Ανάπτυξη καλλυντικοτεχνικών συστατικών απο τοπικά στελέχη θαλάσσιου φυτοπλαγκτού

• In vitro αξιολόγηση της πιθανής κυτταροτοξικότητας και της βιοδραστικότητας επιλεγμένων κλασμάτων μικροφυκών σε ανθρώπινα πρωτογενή δερματικά κύτταρα (ινοβλάστες και κερατινοκύτταρα)

Για τον προσδιορισμό της τοξικότητας και της βιοδραστικότητας των εκχυλισμάτων από τα παραγόμενα στελέχη μικροφύκών πραγματοποιήθηκε in vitro δοκιμή σε ανθρώπινες κυτταροσειρές. Πιο συγκεκριμένα, για το σκοπό αυτό αναπτύχθηκε πρωτόκολλο καλλιέργειας ανθρώπινων δερματικών κυττάρων, ινοβλαστών (NHDF-Ad – Human Dermal Fibroblasts, Adult). Στην κυτταροσειρά αυτή εφαρμόστηκαν επιλεγμένα εκχυλίσματα μικροφυκών σε συγκεκριμένες συγκεντρώσεις και προσδιορίστηκε η in vitro κυτταροτοξικότητα τους.

Επόμενος στόχος ήταν να εκτιμηθεί η πιθανή βιοδραστικότητα των εκχυλισμάτων των μικροφυκών υπό την επίδραση οξειδωτικού στρες. Αρχικά προσδιορίστηκε με τη μέθοδο ΜΤΤ μια συγκέντρωση υπεροξειδίου που προκαλεί ήπια κυτταροτοξικότητα στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά NHDF. Στη συνέχεια εφαρμόστηκαν στην κυτταροσειρά συγκεκριμένες συγκεντρώσεις εκχυλισμάτων για 24 και 48 ώρες και μετρήθηκε εκ νέου η βιωσιμότητα τους με τη μέθοδο ΜΤΤ. Επίσης, προκειμένου να εκτιμηθεί η μεταγραφική επίδραση των εκχυλισμάτων στην κυτταρική σειρά NHDF χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της αντίστροφης μεταγραφής ακολουθούμενη από ποσοτική PCR (RT-qPCR) με σκοπό τη μελέτη των σχετικών επιπέδων έκφρασης επιλεγμένων γονιδίων που εμπλέκονται σε αποκρίσεις οξειδωτικού στρες και άλλους μηχανισμούς. Τέλος προσδιορίστηκε και η επουλωτική δράση των επιλεγμένων εκχυλισμάτων.

• Παραγωγή βιομάζας από επιλεγμένα στελέχη φυτοπλαγκτόν και η ανάπτυξη ήπιων φιλικών περιβαλλοντικά μεθόδων για την εκχύλιση και το χαρακτηρισμό καλλυντικοτεχνικών κλασμάτων (ενεργοί πολυσακχαρίτες και εξωπολυσακχαρίτες, αντιοξειδωτικά, έλαια, ένζυμα) με την εφαρμογή τόσο κλασικών βιοχημικών όσο και σύγχρονων -ομικών τεχνολογιών

Μελετήθηκαν διεξοδικά διάφορες μέθοδοι εκχύλισης (ποικίλες μέθοδοι κυτταρικής διάρρηξης και διάφοροι διαλύτες) ούτως ώστε να αναπτυχθεί νέο πρωτόκολλο που να είναι ταυτόχρονα φιλικό προς το περιβάλλον και με υψηλή απόδοση.
Επίσης, για τα απομονωμένα στελέχη πραγματοποιήθηκε αξιολόγηση του αντιοξειδωτικού δυναμικού τους με τη μέθοδο προσδιορισμού αναγωγικής δράσης-FRAP (Ferric Reducing Activity Power), προσδιορισμός των ολικών φαινολικών ενώσεων με τη δοκιμασία συνολικής περιεκτικότητας φαινολικών με αντιδραστήριο Folin- Ciocalteu καθώς και προσδιορισμός των ολικών φλαβονοειδών. Προκειμένου να χαρακτηριστούν οι καλλυντικοτεχνικές δράσεις επιλεγμένων εκχυλισμάτων, αυτά χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της ενεργότητας τυροσινάσης και ελαστάσης.
Για το σύνολο των απομονωμένων στελεχών προσδιορίστηκε το μεταβολικό τους προφίλ με τη μέθοδο GC-MS καθώς και η περιεκτικότητα τους σε ολικά λιπαρά. Ο χαρακτηρισμός ολοκληρώθηκε με τη μελέτη των παραγόμενων από τα μικροφύκη πολυσακχαριτών.

• Χαρακτηρισμός και ταξινόμηση των απομονωμένων στελεχών τόσο με παραδοσιακές όσο και με σύγχρονες μοριακές μεθόδους ταξινομικής.

Στα πλαίσια της δεύτερης ενότητας εργασίας πραγματοποιήθηκε βιοκινητική ανάλυση με προσδιορισμό των καμπυλών ανάπτυξης των απομονωμένων στελεχών. Συνολικά, όλα τα απομονωμένα στελέχη παρουσιάζουν υψηλό καλλιεργητικό δυναμικό και είναι άρα υποψήφια για παραγωγική εκμετάλλευση εμπορικού επιπέδου. Προσδιορίστηκαν συγκεκριμένα οι παρακάτω βιοκινητικοί δείκτες: μ_max: ειδικός ρυθμός αύξησης, CDW: κυτταρικό ξηρό βάρος, Ν_{t max}: Μέγιστη πυκνότητα κυττάρων, Y_c: κυτταρική πυκνότητα, P_c: παραγωγικότητα κυττάρων, X_{t max}: Μέγιστη πυκνότητα βιομάζας Y_b: κυτταρική πυκνότητα, P_b: παραγωγικότητα βιομάζας.

Επίσης προσδιορίστηκε η περιεκτικότητα των κυττάρων στις φωτοσυνθετικές χρωστικές Chla, Chlb, Chlc και καροτενοειδή, καθώς και τα ολικά λιπίδια και η περιεκτικότητα σε υδατοδιαλυτή πρωτεΐνη των υπό εξέταση στελεχών.  Επιπλέον, προσδιορίστηκε η αντιοξειδωτική ικανότητα των μικροφυκών με τη μέθοδο FRAP αλλά και η περιεκτικότητα τους σε ολικά φαινολικά και φλαβονοειδή.

Για την μορφολογική περιγραφή και ταυτοποίηση ή και νέας ταξινόμησης σε περίπτωση νέου είδους χρησιμοποιήθηκαν αρχικά η φωτονική και η ηλεκτρονική μικροσκοπία. Στη συνέχεια ακολούθησε απομόνωση DNA και αλληλούχιση Sanger για τις περιοχές 18s, RBCL, ITS και TufA. Οι αλληλουχίες αυτές χρησιμοποιήθηκαν για τη μοριακή ταξινόμηση των νέων στελεχών και την κατασκευή φυλογενετικών δένδρων.

• Συλλογή, απομόνωση και καθαρισμός στελεχών θαλάσσιου φυτοπλαγκτού από μεταβατικά οικοσυστήματα

Στα πλαίσια του έργου πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες σε μεταβατικά οικοσυστήματα του Αιγαίου [υδροβιότοπος Κίτρους-λιμνοθάλασσα (7/2020, 8/2021), εκβολές Σπερχειού ποταμού στον Μαλιακό κόλπο (10/2020, 6/2021), υδροβιότοπος Αγίας Τριάδας, Μαλιακός κόλπος (10/2020, 6/2021), εκβολές Γαλλικού ποταμού, Θερμαϊκός κόλπος, Καλοχώρι (10/2020, 6/2021), λιμνοθάλασσα δέλτα Στρυμώνα στον Στρυμωνικό κόλπο (10/2020, 6/2021), κλειστή λιμνοθάλασσα Βιστωνίδας στο Δέλτα Νέστου (10/2020, 6/2021), λιμνοθάλασσα Πόρτο Λάγος στο Δέλτα Νέστου (10/2020, 6/2021), λιμνοθάλασσα Ξηρολίμνη, Δέλτα νέστου (10/2020, 6/2021), λιμνοθάλασσα Καρατζιά, Δέλτα Νέστου (10/2020, 6/2021), λιμνοθάλασσα Μέσης στο Δέλτα Νέστου (10/2020, 6/2021), λιμνοθάλασσα Έλος στο Δέλτα Νέστου (10/2020, 6/2021),] και του Ιονίου [λιμνοθάλασσα Λίμνη Βουλιαγμένη (Ηραίο) στον Κορινθιακό κόλπο (9/2020) – λιμνοθάλασσα Πρόκοπος στον υδροβιότοπο Στροφυλιάς (6/2020), λιμνοθάλασσα Κοτύχι στον υδροβιότοπο Στροφυλιάς (5/2020), λιμνοθάλασσα Κοκκαλά στο δέλτα Αχελώου (3/2020, 6/2021), λιμνοθάλασσα Μεγάλη Κλείσοβα στον υδροβιότοπο Μεσολογγίου (4/2020, 6/2021), λιμνοθάλασσα Πόρτο στον υδροβιότοπο Μεσολογγίου (3/2020, 6/2021), λιμνοθάλασσα Λούρος στον υδροβιότοπο Μεσολογγίου (3/2020, 6/2021), λιμνοθάλασσα Αιτωλικό στον υδροβιότοπο Μεσολογγίου (3/2020, 6/2021)].

Από τις δειγματοληψίες που διενεργήθηκαν απομονώθηκαν περισσότερα από 40 διαφορετικά στελέχη μικροφυκών και αρκετά καθαρίστηκαν σε επίπεδο μονοειδικής καλλιέργειας.

Η επιτυχής έκβαση των εργασιών του έργου εμπλούτισε την τράπεζα στελεχών μικροφυκών του ΕΚΠΑ-ΟΙΚΟ (AthUAl) και έδωσε πρόσβαση στην Ελληνική αλλά και στην Διεθνή επιστημονική κοινότητα σε έμβιους οργανισμούς της Ελληνικής βιοποικιλότητας για ερευνητικές εργασίες σε τομείς τόσο βασικούς όσο και εφαρμοσμένους. Τα οφέλη  διαχέονται και στην βιομηχανία, εγχώρια και διεθνή, που ενδιαφέρεται για στελέχη μικροφυκών όπως π.χ. η υδατοκαλλιέργεια, τα καλλυντικά, τα τρόφιμα, η βιομηχανία υλικών κτλ.

Τα αποτελέσματα που προέκυψαν στα πλαίσια του έργου οδήγησαν στις παρακάτω δημοσιεύσεις σε επιστημονικά συνέδρια με τη μορφή αναρτημένων ανακοινώσεων:

• Koletti A., Chantzistrountsiou X., Zografaki M.E., Marka S., Papadaki S., Tzovenis I., Economou-Amilli A., Flemetakis E. «Characterisation of marine microalgae strains from Greek transient waters for cosmetic applications», Algaeurope 2021, 07-10 December, Online, Abstract book p.270.

• Papadaki S., Chantzistrountsiou X., Ntzouvaras A., Koletti A., Tzovenis I., Flemetakis E., & A. Economou-Amilli (2021). Anti-oxidant capacity of two microalgal strains isolated from Greek salt pans. In 4th International Congress on Applied Ichthyology, Oceanography & Aquatic Environment, 4-6 November 2021 (virtual).

  

  

  

  

  

  

• Koletti A., Efrose R. C., Chantzistrountsiou X., Papadaki S., Tzovenis I., Economou-Amilli A., Flemetakis E. «Molecular phylogenetics of six marine microalgae strains from Greek transient waters», 9th Conference of Microbiokosmos, Athens 16-18 December 2021.

poster Mikrobiokosmos

Τα αποτελέσματα που προέκυψαν στα πλαίσια του έργου οδήγησαν στις παρακάτω δημοσιεύσεις σε επιστημονικά περιοδικά:

• Ntzouvaras, A., Chantzistrountsiou, X., Papageorgiou, N., Koletti, A., Adamakis, I. D., Zografaki, M. E., … & Economou-Amilli, A. (2023). New Records of Tetraselmis sp. Strains with Biotechnological Potential Isolated from Greek Coastal Lagoons. Water, 15(9), 1698.

Water | Free Full-Text | New Records of Tetraselmis sp. Strains with Biotechnological Potential Isolated from Greek Coastal Lagoons (mdpi.com)

 

• Koletti, A., Dervisi, I., Kalloniati, C., Zografaki, M. E., Rennenberg, H., Roussis, A., & Flemetakis, E. (2022). Selenium-binding Protein 1 (SBD1): A stress response regulator in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiology, 189(4), 2368-2381.

Selenium-binding Protein 1 (SBD1): A stress response regulator in Chlamydomonas reinhardtii | Plant Physiology | Oxford Academic (oup.com)

Η προβολή των δραστηριοτήτων και η διάδοση του έργου εγγυώνται ότι η γνώση που θα αποκτηθεί από την πορεία του έργου, θα διαδοθεί τόσο στους συμμετέχοντες φορείς όσο και στο μεγαλύτερο δυνατό κοινό. Αυτό θα επιτευχθεί με ποικίλες δραστηριότητες όπως εκθέσεις προόδου, συνέδρια, δημοσιεύσεις, παρουσιάσεις και σεμινάρια αλλά και ηλεκτρονική διάδοση των πληροφοριών με τη δημιουργία και συντήρηση της ιστοσελίδας του έργου. Η ιστοσελίδα θα περιλαμβάνει όλες τις δραστηριότητες και τις επιστημονικές πληροφορίες που θα παραχθούν κατά τη διάρκεια του έργου. Τα στοιχεία που θα περιλαμβάνονται θα ανανεώνονται περιοδικά με όλα τα σχετικά δεδομένα (αφού δημοσιευθούν), ακόμα και μετά την ολοκλήρωση του έργου.

Το έργο PhyCosmetic-GR σύμφωνα με τα αναμενόμενα αποτελέσματα αναμένεται να έχει πολλαπλά άμεσα και έμμεσα οικονομικά οφέλη τόσο στην Βιομηχανία καλλυντικών όσο και στις Ελληνικές Υδατοκαλλιέργειες. Βέβαια, απευθύνονται πρωτίστως σε αυτήν τη φάση στην αγορά πρώτων υλών για καλλυντικά.

Τα αποτελέσματα του έργου PhyCosmetic-GR θα είναι διαθέσιμα δωρεάν για όλες τις επιχειρήσεις που δραστηριοποιούνται στους συγκεκριμένους τομείς ή υποτομείς.

1)Συλλογή, απομόνωση και η ανάπτυξη στο εργαστήριο τοπικών στελεχών θαλάσσιου φυτοπλαγκτού από μεταβατικά οικοσυστήματα (λιμνοθάλασσες και εκβολές) τα οποία λόγω του ακραία συχνά ευμετάβλητου χαρακτήρα τους ευνοούν την «άνθιση» στελεχών με υψηλό καλλιεργητικό δυναμικό (1ος μήνας – 36ος μήνας/36 μήνες).

• • • Εποχικές δειγματοληψίες σε παράκτια οικοσυστήματα του Αιγαίου και Ιονίου Πελάγους.
    • Ποιοτική και ποσοτική ανάλυση δειγμάτων.
    • Ανάπτυξη στελεχών τοπικού φυτοπλαγκτού.

2) Χαρακτηρισμός και ταξινόμηση των απομονωμένων στελεχών τόσο με παραδοσιακές όσο και με σύγχρονες μοριακές μεθόδους ταξινομικής. Αξιολόγηση των τοπικών στελεχών φυτοπλαγκτού ως προς την ικανότητά τους να παράγουν βιομάζα αποδοτικά σε εντατικά κλειστά συστήματα φωτο-βιοαντιδραστήρων (7ος μήνας – 36ος μήνας/28 μήνες).

• • • Βιοχημικός και βιοκινητικός χαρακτηρισμός απομονωμένων στελεχών.
    • Παραγωγή βιομάζας σε φωτοβιοαντιδραστήρες. 
    • Συστηματική κατάταξη απομονωμένων στελεχών με κλασσικές μεθόδους.
    • Συστηματική κατάταξη απομονωμένων στελεχών με μοριακές μεθόδους.

3) Παραγωγή βιομάζας από επιλεγμένα στελέχη φυτοπλαγκτόν και η ανάπτυξη ήπιων φιλικών περιβαλλοντικά μεθόδων για την εκχύλιση και το χαρακτηρισμό καλλυντικοτεχνικών κλασμάτων (ενεργοί πολυσακχαρίτες και εξωπολυσακχαρίτες, αντιοξειδωτικά, έλαια, ένζυμα) με την εφαρμογή τόσο κλασικών βιοχημικών όσο και σύγχρονων -ομικών τεχνολογιών (10ος μήνας – 36ος  μήνας/26 μήνες).

• • • Αξιολόγηση μεθόδων κυτταρική διάρρηξης και εκχύλισης κλασμάτων βιομορίων υψηλής προστιθέμενης αξίας (λιπιδίων, σακχάρων, αντιοξειδωτικών και πρωτεϊνών) επιλεγμένων μικροφυκών.
    • Προσδιορισμός μεταβολομικού προφίλ τοπικών στελεχών μικροφυκών.
    • Ανάλυση του προφίλ των λιπαρών.
    • Προσδιορισμός επιλεγμένων ενζυμικών δράσεων.
    • Χαρακτηρισμός του κλάσματος των ενεργών πολυσακχαριτών.

4) In vitro αξιολόγηση της πιθανής κυτταροτοξικότητας και της βιοδραστικότητας επιλεγμένων κλασμάτων μικροφυκών σε ανθρώπινα πρωτογενή δερματικά κύτταρα (ινοβλάστες και κερατινοκύτταρα) (13ος μήνας – 36ος μήνας/24 μήνες).

• • • Έλεγχος της κυτταροτοξικότητας επιλεγμένων κλασμάτων μικροφυκών.
    • Μελέτη της προστατευτικής δράσης επιλεγμένων εκχυλισμάτων μικροφυκών έναντι οξειδωτικής καταπόνησης.
    • Μελέτη της επουλωτικής δράσης επιλεγμένων εκχυλισμάτων μικροφυκών.
    • Μελέτη του μοριακού μηχανισμού δράσης επιλεγμένων εκχυλισμάτων μικροφυκών.

http://www.phycosmetic.aua.gr/phycosmetic-gr-schematic-2/